(Practical – hemosatis)
Giới thiệu
Antithrombin (AT) là một chất chống đông máu tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong quá trình cầm máu bằng cách ức chế các protease serine Thrombin (IIa), Yếu tố Xa (FXa) và Yếu tố XIa (FXIa), Yếu tố IXa (FIXa) nhưng ở mức độ thấp hơn.
Sự thiếu hụt Antithrombin di truyền làm tăng nguy cơ huyết khối tĩnh mạch (VTE) và có thể được phát hiện ở 1-2% bệnh nhân VTE so với 0,02-0,2% dân số bình thường. Thiếu Antithrombin di truyền có tỷ lệ phổ biến trong dân số chung là từ 0,2 / 1000 đến 0,5 / 1000.
Antithrombin được tổng hợp chủ yếu ở gan và lưu thông trong huyết tương dưới dạng protein chuỗi đơn gồm 432 axit amin với trọng lượng phân tử là 58.200 Dalton. Nồng độ bình thường trong huyết tương là 150 µg / mL và thời gian bán thải trong huyết tương khoảng 3 ngày.
Gen mã hóa AT [SERPINC1] nằm trên nhiễm sắc thể số 1 và nhiều loại đột biến đã được xác định ở những người bị thiếu Antithrombin và huyết khối tĩnh mạch.
AT huyết tương có thể được đo bằng cả xét nghiệm miễn dịch (định lượng) hoặc chức năng (chất lượng) và dựa trên cơ sở của các xét nghiệm này, người ta phân loại tình trạng thiếu hụt Antithrombin.
Phân loại sự thiếu hụt Antithrombin
| Phân loại | Giải thích |
| Loại I | AT giảm cả nồng độ và chức năng xuống khoảng 50% so với bình thường. |
| Loại II | AT giảm chức năng nhiều hơn so với giảm nồng độ |
| Loại II HBS | Đột biến ảnh hưởng đến vùng liên kết heparin [vị trí] của Antithrombin |
| Loại II RS | Các đột biến ảnh hưởng đến vị trí phản ứng của Antithrombin |
| Loại II PL | Đột biến ảnh hưởng đến cả vùng liên kết heparin và vị trí phản ứng của phân tử, tức là đột biến Pleiotropic. |
Nguyên lý xét nghiệm & Phương pháp
Xét nghiệm AT chức năng dựa trên nguyên lý ức chế FIIa hoặc FXa bởi Antithrombin khi có mặt heparin. Tác dụng chống FXa hoặc chống FIIa của AT có thể được đo bằng xét nghiệm đông máu hoặc xét nghiệm chromogenic (sinh màu), xét nghiệm Chromogenic thường được sử dụng vì nó thuận tiện hơn.
1.Xét nghiệm Chromogenic: Có ba xét nghiệm Antithrombin chromogenic dựa trên cơ sở ức chế FIIa bò, FXa ở người và FIIa ở người, tất cả đều dựa trên một nguyên tắc tương tự. Huyết tương được ủ với lượng dư thừa chất nền liên quan [Thrombin hoặc Factor Xa] khi có mặt Heparin với lượng dư. Heparin gắn và gây ra sự thay đổi cấu trúc của Antithrombin làm tăng đáng kể hoạt động ức chế của nó. Chất nền sinh màu đặc trưng cho protease, ví dụ: Thrombin hoặc Yếu tố Xa – sau đó được thêm vào và hoạt tính còn lại của protease gây ra sự phân cắt chất nền và thay đổi màu sắc buồng phản ứng. Độ hấp thụ đo được ở bước sóng 405nm tỷ lệ nghịch với nồng độ hoạt động AT trong mẫu huyết tương.
| Cơ chất | Nguyên tắc của thử nghiệm |
| Thrombin người (FIIa) | Huyết tương được pha loãng với nước muối cộng với sự hiện diện của Heparin được ủ 90 giây với lượng FIIa người dư thừa tạo thành phức hợp AT-Thrombin-Heparin.FIIa người dư thừa xúc tác giải phóng p-nitroanaline (pNa) từ chất nền sinh màu. Độ hấp thụ đo được ở bước sóng 405nm tỷ lệ nghịch với nồng độ hoạt động AT trong mẫu.
Heparin cofactor II có thể ảnh hưởng đến các xét nghiệm dựa trên FIIa người và có thể dẫn đến kết quả sai lệch. |
| Thrombin bò (FIIa) | Huyết tương được pha loãng trong nước muối và ủ 30 giây trong dung dịch đệm có chứa dư thừa FIIa bò và heparin sulphat. Hoạt động FIIa bò còn lại được đo bằng cách sử dụng chất nền tạo màu nhạy cảm với FIIa. Tốc độ màu tạo ra ở bước sóng 405nm tỷ lệ nghịch với nồng độ hoạt động AT. |
| Factor Xa bò | Huyết tương được pha loãng với nước muối và ủ 90 giây với lượng dư FXa bò khi có mặt heparin. FXa dư được đo bằng tốc độ thủy phân của chất nền tạo màu S-2765. PNa được giải phóng được đo ở bước sóng 405nm và tỷ lệ nghịch với mức hoạt động AT trong mẫu. |
2.Xét nghiệm miễn dịch
| Xét nghiệm | Nguyên lý |
| Xét nghiệm Elisa | Kháng nguyên AT (AT: Ag) thường được đo bằng cách sử dụng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA). Các giếng microtitre được phủ một lớp huyết thanh kháng AT đa dòng. Pha loãng huyết tương bệnh nhân, huyết tương chứng và huyết tương pool bình thường, thêm vào đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng. Sau ủ, kháng nguyên AT trong huyết tương sẽ liên hợp với kháng thể chống AT có sẵn trong giếng. Tiến hành 1 chu trình rửa, thêm chất nền và đo độ hấp thụ của mỗi giếng ở bước sóng 490 nm. Một đường cong chuẩn có thể được xây dựng từ huyết tương chuẩn và từ đó có thể suy ra hoạt tính AT của các mẫu chưa biết. |
| Xét nghiệm điện di miễn dịch Laurell | Trong lịch sử, Antithrombin [và nhiều protein] được đo bằng phương pháp Electroimmunoassay [EIA] – được gọi là ‘Tên lửa Laurell’. Nguyên tắc rất đơn giản: một kháng thể đặc hiệu với protein cần quan tâm [trong trường hợp này là Antithrombin] được trộn với agarose nóng chảy và đổ vào một vật liệu hình chữ U được kẹp giữa hai mảnh thủy tinh. Sau khi đông kết, gel được kết dính vào một trong hai tấm kính. Một hàng giếng 2-2,5mm cách nhau khoảng 1cm được đục lỗ vào gel. Thêm vào mỗi giếng một lượng 5µL huyết tương thử nghiệm hoặc huyết tương chuẩn. Phải tạo một series các nồng độ pha loãng của huyết tương chuẩn để sau đó xây dựng đường chuẩn. Tấm thạch được định vị trong bể điện di sao cho chiều dòng điện ở góc phải với dãy giếng. Tiến hành điện di với dòng điện không đổi trong 14-18 giờ. Vào cuối giai đoạn này, tấm gel được rửa sạch, thấm khô và các phức hợp kháng nguyên kháng thể được phát hiện bằng cách nhuộm trong Coomassie Blue – xem bên dưới. |
Đường chuẩn được xây dựng bằng cách vẽ biểu đồ chiều cao của một loạt các dung dịch pha loãng của plasma chuẩn. Chiều cao tên lửa (mm) được vẽ trên trục X tuyến tính và nồng độ trên trục logarit Y [xem bên dưới.] Từ biểu đồ này, nồng độ của các ẩn số có thể được suy ra, ví dụ: chiều cao đỉnh 108mm tương ứng với nồng độ AT: Ag là 720%. Các mẫu huyết tương chưa biết khác có thể được tính toán bằng phương pháp tương tự.
Biện luận kết quả
Có sự khác biệt rõ ràng về khả năng của các xét nghiệm AT khác nhau trong việc phát hiện tất cả các biến thể của Antithrombin. Xét nghiệm với thuốc thử Thrombin (FIIa) bò dường như là xét nghiệm nhạy cảm nhất và có thời gian ủ ngắn, có thể phát hiện tất cả các biến thể Antithrombin bao gồm cả các biến thể đột biến liên kết với heparin. Ngược lại, xét nghiệm với thuốc thử FIIa người và FXa bò có thể không phát hiện được số lượng đáng kể các biến thể quan trọng về mặt lâm sàng. Sự khác biệt về độ nhạy của ba xét nghiệm có thể phản ánh khiếm khuyết phân tử cơ bản, sự hiện diện của các chất ức chế serine protease khác hoặc sự thay đổi trong thời gian ủ của xét nghiệm.
Thiếu hụt Antithrombin mắc phải đã được báo cáo ở:
– Rối loạn chức năng gan
– Tăng tiêu thụ như trong Nhiễm trùng huyết / DIC, Tiền sản giật, AML
– Liên quan với L-Asparaginase
– Protein niệu
– Liệu pháp heparin có thể dẫn đến giảm nồng độ Antithrombin
– Viêm loét đại tràng và Crohn đang hoạt động
– Dinh dưỡng kém
– Pha loãng: Lọc máu, bắc cầu tim phổi, điện di huyết tương
Dải tham chiếu
Trẻ sơ sinh có mức Antithrombin giảm khi sinh (30-50% ở mức trưởng thành) nhưng tăng lên xấp xỉ 60% ở mức trưởng thành 1 tháng sau khi sinh và đạt đến giá trị của người lớn vào lúc 6 tháng tuổi.
Khoảng tham chiếu cho người lớn đối với Antithrombin ở nam giới là 74-126 IU / dL và ở phụ nữ là 71-130 IU / dL (khá tương tự nhau)
Làm gì khi có kết quả Antithrombin thấp:
Ở những cá nhân có xét nghiệm Antithrombin thấp, điều quan trọng là phải xác định xem đây là do đột biến Loại I hay Loại II và liệu đột biến này có ảnh hưởng đến vị trí liên kết heparin, vị trí phản ứng hoặc cả hai hay không. Điều này thường đạt được bằng cách giải trình tự gen Antithrombin [SERPINC1]. Các tư vấn di truyền cần dựa trên cơ sở thông tin về đột biến gen.
Sơ đồ dưới đây giúp điều tra một cá nhân bị nghi ngờ thiếu Antithrombin:
 là một chất chống đông máu tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong quá trình cầm máu bằng cách ức chế các protease serine){kind=link}