Xét nghiệm Protein C

Xét nghiệm Protein C (pratical – hemostasis)

Giới thiệu

Protein C là một protease serine phụ thuộc vitamin K có trọng lượng phân tử 62kDa và là thành phần quan trọng của quá trình chống đông máu tự nhiên. Protein C là một polypeptit gồm 2 chuỗi – một chuỗi nhẹ [155 acid amin] và một chuỗi nặng [262 acid amin] được liên kết với nhau bằng liên kết disunphide.

Chuỗi nhẹ bao gồm miền Gla, với 9 gốc axit glutamic được gamma-cacboxyl hóa trong gan – một phản ứng phụ thuộc vào Vitamin K. Miền GLA tương tác với phospholipid tích điện âm khi có mặt ion canxi và cần thiết cho chức năng chống đông máu của Protein C hoạt hoá [APC].

Protein C được chuyển đổi bởi Thrombin [IIa] thành dạng hoạt động của nó [Protein C hoạt hóa – APC), cùng với đồng yếu tố Protein S, sẽ phân hủy Yếu tố Va và Yếu tố VIIIa. Điều thú vị là Yếu tố V cũng đóng vai trò là đồng yếu tố cho việc vô hiệu hóa Yếu tố VIIIa bởi APC.

Sự hoạt hóa từ PC thành APC xảy ra tương đối chậm khi chỉ có Thrombin nhưng tốc độ hoạt hóa tăng lên đáng kể [20.000 lần] khi thrombin liên kết với protein xuyên màng Thrombomodulin [Tm] và Protein C liên kết với thụ thể Protein C nội mô [EPCr]. Thrombin liên kết với Tm không có hoạt tính đông máu nhưng có hoạt tính chống đông máu đáng kể thông qua con đường Protein C-Protein S.

Ngoài vai trò chống đông máu, Protein C hoạt hóa thể hiện các hoạt động chống viêm và chống chết theo chương trình. APC cũng liên kết với PAI-1 [Chất ức chế Plasminogen Loại I] và ức chế hoạt động của nó, do đó ngăn chặn sự ức chế T-PA và do đó tăng cường quá trình phân hủy fibrin.

Protein C hoạt hóa bị ức chế bởi Chất ức chế Protein C [PCI – trước đây được gọi là PAI-3] – một thành viên gia đình SERPIN của họ chất ức chế serine protease.

Sự thiếu hụt protein C được di truyền trội, NST thường và làm tăng nguy cơ VTE lên mức độ tùy thuộc vào việc nó là đồng hợp tử hay dị hợp tử.

Thiếu hụt Protein C đồng hợp tử hiếm gặp và xuất hiện ở trẻ sơ sinh bị ban xuất huyết fulminans (một dạng đông máu nội mạch lan tỏa, đặc trưng bởi xuất huyết và hoại tử da trên diện rộng), gây tử vong nhanh chóng trừ khi được điều trị bằng Protein C thay thế. Ở những người bị thiếu hụt Protein C dị hợp tử, Warfarin có thể tạo ra hiện tượng tương tự ngay khi sử dụng do giảm Protein C nhanh chóng (vì Protein C có thời gian bán hủy ngắn), trước khi giảm các yếu tố đông máu phụ thuộc vitamin K khác. Trái ngược với vai trò chống đông máu của Warfarin, trường hợp này lại gây ra sự hình thành huyết khối trong các mạch nhỏ ở da và hoại tử da trên diện rộng. Đó là một hiện tượng hiếm.

Kháng Protein C hoạt hóa là việc Protein C không có khả năng phân cắt các yếu tố Va và / hoặc VIIIa. Điều này có thể do di truyền hoặc mắc phải nhưng thường là do sự bất thường trong mục tiêu hoạt động của Protein C hoạt hóa hơn là do bất thường của bản thân Protein C. Ví dụ phổ biến nhất về kháng Protein C hoạt hóa là do đột biến yếu tố V Leiden.

Phân loại sự thiếu hụt Protein C

Sự thiếu hụt protein C đã được phân loại thành:

Nguyên lý xét nghiệm

Protein C có thể được đo bằng:

1. Xét nghiệm ELISA: chỉ đo lượng Protein C hiện có chứ KHÔNG đo hoạt động chức năng của nó.
2. Xét nghiệm APTT dựa trên cục đông – xác định thời gian hình thành cục máu đông sau khi bổ sung chất hoạt hóa Protein C và từ đó xác định được lượng Protein C hiện có.
3. Xét nghiệm tạo màu – Protein C được kích hoạt bằng cách sử dụng Protac ™ (phổ biến), chiết xuất từ nọc độc của rắn Akistrodon contortrix contortrix và nồng độ Protein C được xác định từ tốc độ thay đổi màu sắc trong mẫu thử do sự phân cắt cơ chất.
4. Xét nghiệm dựa trên sự tạo Thrombin cũng đã được chứng minh để phát hiện sự thiếu hụt Protein C.

Phương pháp

Các kít thương mại luôn sẵn có cho xét nghiệm Protein C và những bộ kít này phải sử dụng chất chuẩn Protein C tham chiếu được hiệu chuẩn theo Tiêu chuẩn quốc tế hiện hành về Protein C.

1. Xét nghiệm Protein C Elisa: Hầu hết các xét nghiệm ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng kháng lại Protein C.
2. Xét nghiệm chức năng Protein C dựa trên thời gian đông: Các xét nghiệm này dựa trên PT hoặc APTT, mặc dù APTT được sử dụng phổ biến hơn. Huyết tương nghèo tiểu cầu của bệnh nhân được ủ ở 37 ° C với phospholipid, chất hoạt hóa tiếp xúc (ví dụ: Kaolin) và chất hoạt hóa Protein C (ví dụ: Protac). Sau khi ủ (thường 1-4 phút) canxi được thêm vào để bắt đầu đông máu. Thời gian hình thành cục máu đông được đo lường. Từ đó, mức Protein C được xác định từ đường cong tham chiếu.

Xét nghiệm protein C dựa trên thời gian đông

Thời gian đông của APTT [hoặc PT] sẽ bị ảnh hưởng bởi lượng Va hoặc VIIIa có trong hỗn hợp phản ứng, lượng Va và VIIIa lại bị ảnh hưởng bởi hoạt tính của Protein hoạt hóa C [APC]. APC được tạo ra từ Protein C thành Protein bởi Protac. Vì vậy, nếu có sự giảm nồng độ Protein C trong tuần hoàn thì sẽ tạo ra ít APC hơn, do đó ít Va và VIIIa bị bất hoạt hơn và thời gian đông máu sẽ ngắn hơn.

Các thuốc thử và mẫu sử dụng:

• Huyết tương nghèo tiểu cầu
• Chất hoạt hóa bề mặt: Kaolin, Silica micronized, Celite, Axit Ellagic
• Phospholipid: Ví dụ Cephalin – để thay thế phospholipid tiểu cầu
• Chất hoạt hóa protein C: Phổ biến nhất là ‘Protac’ một loại nọc rắn
• Canxi: Canxi là cần thiết, được cho dư thừa để quá trình đông tụ xảy ra.

Xét nghiệm protein C chromogenic:

Huyết tương nghèo tiểu cầu của bệnh nhân được ủ ở 37 ° C với chất hoạt hóa Protein C, ví dụ: Protac. Sau khi ủ (thường là 5 phút), một chất nền tạo màu cho Protein C hoạt hóa được thêm vào. Sự thay đổi mật độ quang được đo và so sánh với đường cong tham chiếu tiêu chuẩn, từ đó mức Protein C được xác định. Lưu ý rằng không cần canxi, phospholipid hay chất hoạt hoá đông máu vì huyết tương cần xét nghiệm chỉ đóng vai trò là nguồn cung cấp Protein C và sự hình thành cục máu đông là không cần thiết đối với xét nghiệm này. Xét nghiệm sinh màu không bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của chất kháng đông lupus, nồng độ yếu tố VIII hoặc sự hiện diện của đột biến Yếu tố V Leiden.

Biện luận kết quả

Không có xét nghiệm Protein C đơn lẻ nào nhạy 100% và đặc hiệu 100% cho các bất thường:

1. Xét nghiệm ELISA đo nồng độ Protein C với độ nhạy rất cao nhưng không phát hiện ra các khiếm khuyết chức năng. Các xét nghiệm ELISA có thể có khác biệt về độ đặc hiệu, đặc biệt là trong các mẫu lâm sàng, ví dụ: mẫu từ những bệnh nhân đang dùng thuốc đối kháng vitamin K. Protein C tạo phức với chất ức chế của nó có thể được nhận biết bằng một số xét nghiệm ELISA nhưng không nhận biết được bằng các xét nghiệm khác.
2. Xét nghiệm Chromogenic phát hiện nồng độ thấp của Protein C với độ nhạy cao và phát hiện hầu hết các khiếm khuyết chức năng nhưng không phải tất cả – ví dụ, liên kết phospholipid bị suy giảm do đột biến trong vùng Gla sẽ không được phát hiện vì xét nghiệm tạo màu không phụ thuộc vào phospholipid . Một cá thể có đột biến trong vùng GLA của gen PROC sẽ có xét nghiệm Protein C chromogenic bình thường. Tương tự, xét nghiệm sinh màu không phụ thuộc vào sự hiện diện của Protein S. Xét nghiệm sinh màu cũng có thể bị ảnh hưởng bởi các protease serine khác dẫn đến ước tính quá mức mức Protein C.
3. Một xét nghiệm Protein C chức năng dựa trên APTT có thể đem lại một kết quả Protein C thấp giả khi có đột biến Yếu tố V Leiden; tăng nồng độ yếu tố VIII huyết tương; tăng lipid máu; và một số nguyên nhân khác gây ra tình trạng kháng Protein C hoạt hóa. Kết quả bình thường sai có thể xảy ra khi có chất kháng đông lupus và ở những bệnh nhân đang dùng thuốc ức chế thrombin trực tiếp khi sử dụng xét nghiệm chức năng dựa trên APTT. Các xét nghiệm Protein C chức năng dựa trên cục đông đông không được khuyến khích sử dụng thường xuyên nhưng có thể có giá trị trong việc xác định các biến thể Loại IIb.

Nguyên nhân thiếu hụt Protein C:

Di truyền:

+ Thiếu hụt Protein C dị hợp tử – gặp ở 0,2% dân số và 3% bệnh nhân bị huyết khối tĩnh mạch

+ Thiếu hụt Protein C đồng hợp tử – hiếm gặp.

Mắc phải: (phổ biến hơn nhiều so với thiếu hụt di truyền):

• Phản ứng giai đoạn cấp tính
• Đông máu nội mạch lan tỏa [DIC]
• Bệnh gan
• Liệu pháp L-Asparaginase
• Thuốc đối kháng vitamin K
• Bệnh hồng cầu hình liềm

Dải tham chiếu

Nồng độ Protein C trong huyết tương ở một trẻ sơ sinh khỏe mạnh khoảng 40 IU / dL. Nồng độ tăng lên theo tuổi và đạt đến mức 60 IU / dL nhưng có thể không đạt đến giá trị thực sự của người lớn cho đến sau tuổi dậy thì. Mức Protein C bình thường ở người lớn nằm trong khoảng 65–135 IU / dL.

Làm gì khi có kết quả Protein C thấp:

Các xét nghiệm dựa trên APTT có thể bị ảnh hưởng bởi các kháng thể kháng phospholipid và bệnh nhân nên được sàng lọc các kháng thể này.

Bệnh nhân có thể có dị hợp tử kép phối hợp cả bất thường loại 1 và 2 và do đó có thể cần thực hiện các xét nghiệm chức năng khác nhau cũng như đo lường kháng nguyên để xác nhận sự thiếu hụt gần như hoàn toàn.

Thiếu hụt Protein C đồng hợp tử thường được chẩn đoán ở trẻ sơ sinh với nồng độ rất thấp gần như không phát hiện được. Tuy nhiên, phạm vi bình thường đối với trẻ sơ sinh là rất rộng và sự thiếu hụt dị hợp tử có thể cần phải xét nghiệm lặp lại sau 6 tháng để khẳng định. Đo lường nồng độ Protein C của cha mẹ có thể hữu ích.

Việc xác định protein C thường được thực hiện như một phần trong chẩn đoán bệnh huyết khối. Các xét nghiệm khác bao gồm Protein S, xét nghiệm đột biến gen FV Leiden và đột biến gen Prothrombin G20210A, mức homocysteine. Nguyên nhân Protein C thấp mắc phải nên được kiểm tra [Mức độ của cả Protein C và Protein S sẽ thấp ở những bệnh nhân đang sử dụng thuốc đối kháng vitamin K như Warfarin.]

Phân tích đột biến gen Protein C – PROC – nên được thực hiện trong mọi trường hợp thiếu Protein C, cần thiết để tư vấn di truyền.